作者：梅世月白楠胡爽刘宁刘莉娜孔祥东
作者单位：医院遗传与产前诊断中心
通讯作者：孔祥东，kongxd
.net基金项目："十二五"国家科技支撑计划项目
引用格式：梅世月,白楠,胡爽,等.异戊酸血症家系基因变异二例分析及其中一例产前诊断[J].中华围产医学杂志,,21(1):31-35.DOI:10./cma.j.issn.-..01.
摘要
目的对2例异戊酸血症家系的临床诊断和基因变异进行分析，并对其中1例再次妊娠的孕妇进行产前基因诊断。
方法（1）家系1患儿（先证者）临床诊断为异戊酸血症，于生后14d死亡。取患儿及其父母的外周静脉血，及其母亲再次妊娠时的羊水标本（孕18周），进行产前基因诊断。以聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）-Sanger测序方法检测IVD基因编码区序列变异。（2）家系2为近亲婚配家庭，先后2个新生儿疑似"新生儿遗传代谢病"并死亡。取夫妇双方外周静脉血标本，采用高通量基因测序方法进行产前基因诊断。
结果（1）家系1：先证者IVD基因存在c.GC(p.DH)和c.-3_-2delinsGG复合杂合变异。产前诊断结果显示家系1再孕胎儿携带与母亲一致的c.GC(p.DH)杂合变异，未遗传父亲的c.-3_-2delinsGG变异。告知先证者父母，胎儿出生后患异戊酸血症表型的可能性小，家属选择继续妊娠。胎儿足月分娩，生后尿液有机酸分析和酰基肉碱层析分析均未见异常；随访至2岁，体格和智力发育均未见异常。（2）家系2患儿父母IVD基因携带相同的c.AG(p.YC)杂合变异。未发现与已故患儿临床表型相关或相近的疑似致病基因突变。已故2例患儿的临床症状与异戊酸血症相符，推测这2例患儿可能同时遗传了父母双方致病变异，从而导致异戊酸血症。
结论通过产前基因诊断，明确了这2个家系的遗传学病因。其中，家系1的c.GC(p.DH)为尚未见报道的新变异，为可能的致病性变异。
异戊酸血症（isovalericacidemia）又称异戊酰辅酶A脱氢酶缺乏症，是一种常染色体隐性遗传的有机酸代谢病。本病是由于亮氨酸分解代谢途径中异戊酰辅酶A脱氢酶的先天性缺陷，导致异戊酸及其代谢产物在体内堆积，引起代谢性酸中*和神经系统损害。典型的异戊酸血症患儿出生时多无异常表现，在新生儿早期（通常在生后1周内）起病，表现为拒乳、呕吐、反应差、脱水、嗜睡和四肢肌张力低等症状，呼气和体液多有"汗脚样"特殊气味[1,2]。患儿多出现严重的代谢性酸中*、酮尿、高氨血症和低钙血症，病情进展迅速，如得不到及时有效治疗，发病后致死、致残率极高[3,4]。目前异戊酸血症仍无有效的治疗手段。据报道，异戊酸血症在各国的发病率存在差异，其中在我国台湾地区为1/36.5万[5]，而我国大陆地区发病率尚未见报道，对本病患儿进行基因检测的报道也较少。
本研究对2例异戊酸血症家系进行了基因变异分析。根据患儿的临床诊断资料，采取不同的基因分析策略。对家系1患儿临床资料分析，并明确诊断为异戊酸血症；应用聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）-Sanger方法检测IVD基因编码区序列变异情况，并在此基础上进行胎儿羊水产前基因诊断。家系2患儿临床诊断不明确，疑似遗传代谢病。该患儿已经死亡，本研究应用目的基因捕获结合高通量基因测序技术分析患儿母亲多种遗传代谢疾病致病基因，检测到患儿母亲存在已知致病性变异，然后针对患儿父亲检测IVD基因，揭示了导致该家系2个患儿夭折的可能遗传病因。
一、临床资料
1．家系1（图1A）：
▲图1本研究2个家系的系谱图 A：家系1；B：家系2
先证者男性，7d，因"精神、吃奶差2d"入院。患儿系第1胎第1产，足月阴道分娩，无缺氧、窒息史，生后5minApgar评分10分。生后5d，患儿无明显诱因出现反应差，少哭少动，吃奶量明显减少，呕吐，无发热、咳嗽症状，未予特殊处理，至生后7d病情加重入院。入院体格检查：成熟儿貌，反应欠佳，神志清楚。肤色尚红润，皮肤无硬肿，皮肤弹性正常，全身有特殊"汗脚样"体味。四肢未见异常，活动无受限，觅食反射减弱，吮吸反射减弱，双手握持反射减弱，拥抱反射减弱。双肺呼吸音粗，可闻及较多细湿啰音。心音有力，心律齐，未闻及杂音。脐部可见脓性分泌物。腹部稍胀，尚软，肝脾肋下未及。实验室检查：白细胞计数明显降低，连续数日检测发现白细胞计数逐渐下降。血糖2.4mmol/L（降低），血氨μmol/L（升高）、乳酸2.41mmol/L（升高）。天冬氨酸转氨酶U/L（升高），肌酸激酶U/L（升高）。血气分析示代谢性酸中*，低钙血症。脑脊液蛋白定性和糖定性均为阳性。脑电图示广泛性电压下降，双侧枕区较多位相尖波、尖形慢波发放。头颅CT：双侧脑室旁白质密度稍低。后纵裂及天幕缘少量积血。遗传代谢病串联质谱：酰基肉碱C5浓度及C5/C4的比值明显高于正常值，提示异戊酸血症，甲基丁酰辅酶A脱氢酶缺乏。尿气相质谱：异戊酰甘氨酸增高。入院后，予5%碳酸氢钠、10%葡萄糖、左旋肉碱、甘氨酸及静脉补液等治疗。患儿病情未见好转。入院第5天出现呼吸抑制、血氧饱和度下降，予气管插管、呼吸机辅助通气。患儿昏迷，病情危重，家长考虑患儿病情及家庭经济原因，要求放弃治疗。患儿于次日（入院第6天）出院，出院1d后死亡。父母体健，否认近亲婚配，否认家族遗传代谢性疾病史，其母否认妊娠合并症或并发症。现患儿母亲再次妊娠，为预防此类患儿出生，要求进行产前基因诊断。
2．家系2（图1B）：为1个有2次疑似遗传代谢病患儿生育史的家系，夫妻双方体健，近亲婚配，否认家族遗传代谢性疾病史。第一胎为男性，足月阴道分娩，出生无明显异常，生后5d吃奶量明显减少，反应差，反复呕吐，阵发性抽搐，嗜睡，昏迷，并且全身有特殊"汗脚样"体味，无发热、咳嗽症状，于生后12d死亡。第二胎为女性，临床表现与其兄类似，于生后14d死亡，初步诊断为"新生儿遗传代谢病，疑似异戊酸血症，代谢性酸中*，新生儿败血症"，但没有详细的临床病理检查资料，也没有留存已故患儿组织样本。该夫妇为明确病因，避免再次生育类似患儿，到本院咨询。
二、研究方法
本研究经医院医学伦理委员会批准，所有基因诊断均取得患者及家属的书面知情同意。
1．标本采集：
（1）外周血：取家系1患儿及其父母、家系2患儿父母双方外周静脉血2~3ml，乙二胺四乙酸抗凝；（2）羊水：家系1孕妇于孕18周在B超引导下行羊膜腔穿刺，抽取羊水标本约20ml，置于无菌容器中，立即送实验室。
2．胎儿产前诊断：
羊水标本提取基因组DNA，利用PowerPlex16HS试剂盒（美国Promega公司）排除羊水母体污染，应用上述PCR引物及反应条件对胎儿IVD基因进行针对性变异检测。
3．DNA提取：
外周血和羊水样本采用Omega公司"基因组DNA抽提试剂盒"提取基因组DNA，操作步骤按照试剂盒的说明书进行。
4．PCR扩增及家系分析：
引物设计参考文献[6]，特异性扩增IVD基因每一个外显子及侧翼序列。以基因组DNA（50~ng）为模板，采用常规PCR扩增体系（天根生化科技公司）。PCR反应条件：95℃预变性2min；循环扩增：95℃变性30s，56~60℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，鉴定产物大小与预期相符。把PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行双向测序，测序结果经Chromas软件与IVD基因参考序列（NM_）进行比对分析。
5．高通量测序：
采用基因捕获技术结合Illumina测序平台，对多种遗传代谢（包括氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢）疾病相关致病基因的外显子区进行高通量测序。取待测样本DNA，利用基因捕获技术将待测遗传代谢疾病相关基因的外显子及相邻内含子区域（约50bp）进行捕获与富集。对富集的基因进行质量控制，利用IlluminaNextseq测序仪对其进行测序。
6．数据分析：
原始的测序数据去除低质量测序读长和接头序列，运用Burrows-WheelerAligner（BWA）软件与人类基因组hg19参考序列进行比对，再用GenomeAnalysisToolkit（GATK）软件找出其中的SNP、Indel变异位点。本部分内容委托迈基诺医学检验中心完成。针对高通量测序得到的疑似致病变异，采用PCR-Sanger测序的方法进行验证。
7．生物信息学分析：
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