一.概述
清洁是通过物理或化学的方法去除杂质的过程。消*的目的是将微生物降低到一个安全可控的水平。清洁和消*是独立的，且密不可分的两个步骤，有效的清洁可大大提高消*的效果。
生物工艺下游环节需要在时间短，温度低，pH适中等严苛的GMP条件下进行，严格的清洗消*流程可以保证填料及生产设施的安全性，正确的清洗消*方式对填料的使用寿命有很大帮助。
二.常见杂质与清洗消*剂的选择
2.1
常见杂质的分类
ICH标准中指出，生物工艺中的杂质主要有工艺相关杂质，产品相关杂质以及其他外源性污染物。
2.2
常见清洗剂及应用
根据清洗剂的pH不同，我们把清洗剂分为碱性、酸性、中性清洗剂以及其他有机溶剂。
氢氧化钠是最常用的清洗剂，它可以通过分散、皂化等作用溶解蛋白、脂类等杂质，且价格较低。需要注意的是过高的氢氧化钠浓度会使蛋白类污垢变性，反而增加清洗难度，生物工艺用氢氧化钠浓度一般不超过1M。
清洗需灵活组合温度、时间、机械力和化学作用四种要素，通常，CIP（原位清洗）工艺温度越高，流速越快（湍流），时间越长，药剂浓度越高，清洗效果则最佳。
生物工艺纯化用填料比较敏感，温度过高会导致蛋白变性，流速过快会导致药剂成本过高，可通过增强化学作用和清洗时间进行弥补。比如，使用两种化学药剂（氢氧化钠+1M氯化钠或硫酸钠），可去除蛋白或核酸。当pH受限时，可用偏中性的蛋白变性剂——6M的盐酸胍或者8M的尿素进行清洗。脂类或脂蛋白，可用20%乙醇或者20%异丙醇（有数据显示20%异丙醇浸泡20分钟后还可以有效去除色素残留）或者TritonX-清洗。
除了增强化学作用，延长有效的清洗时间也是去除杂质的重要方法，比如1M氢氧化钠处理5h可以将内*素降低到可接受水平。
2.3
常见消*剂与应用
生物工艺中常见的消*用试剂有氢氧化钠、乙醇、异丙醇、苯甲醇，次氯酸钠、过氧化氢、过氧乙酸等。强氧化剂消*效果好，但与填料化学兼容性差，有刺激性气味，一般用在环境或硬件消*。纯化工艺用消*剂相对温和，如氢氧化钠，乙醇或异丙醇浸泡消*。
从消*效果来看，消*剂的选择顺序是异丙醇乙醇氢氧化钠。异丙醇（二甲基甲醇）含有两组甲基，亲脂性增强，渗透力高于乙醇（一组乙基），对细菌和霉菌的杀灭能力更佳，使用浓度更宽，低浓度下也能保持良好的杀菌效果。另外，异丙醇常温下饱和蒸气压比乙醇小，使用更安全，是FDA认可推荐用醇类消*剂，除用于填料的消*、保存外，还被广泛用于空间和硬件表面的消*。与氢氧化钠相比，醇类消*剂杀菌效果更好，可以释放孢子的DPA（吡啶二羧酸），使其不能复苏。1M氢氧化钠浸泡消*后的孢子，DPA没有丢失，消*效果并不彻底。低浓度的氢氧化钠（10mM-25mM）可以起到抑菌的效果[1]。某些不耐受0.5M的氢氧化钠的填料，可使用PAB缓冲液（mM磷酸，mM乙酸，2.2%苯甲醇）进行浸泡消*。
三.常见填料及硬件的化学兼容性
下游纯化工艺中，层析填料的清洗消*流程相对比较复杂，要重点考虑填料与化学药剂的兼容性。填料的基质、连接臂和配基是兼容性考虑的三个重要因素。
填料的基质分为硅胶、聚合物和二氧化铝等几大类，纯硅胶或者多孔玻璃基质在高碱性条件下不是特别稳定。聚合物基质pH使用范围宽，相对于软胶的抗压性也会好很多，如苯乙烯-二乙烯基质，在整个pH范围内都比较稳定，可以用强酸、强碱清洗色谱柱。琼脂糖基质不耐强酸，对低pH条件比较敏感，高交联琼脂糖可以耐受较高的pH。氧化铝基质的结构相对比较稳定，烷基氧化铝能在pH1-12的范围内稳定使用。
另外，配基的敏感性至关重要的，亲和填料的配基一般都是大分子蛋白，不耐受高浓度的氢氧化钠处理。市场上对有一些传统的ProteinA填料经过改造可以耐受0.1-0.5M的氢氧化钠，但ProteinG/L以及分子量更小的羊驼抗体正在研究中，建议根据填料供应商的推荐谨慎使用酸碱性较强的清洗消*剂。
低分子量的配基，如离子交换、疏水以及混合模式层析填料的配基，可以采用更宽的pH范围进行清洗消*。需要注意的是，强阴填料（配基—氨基），遇氢氧化钠可产生三甲胺，虽有试验证明不影响填料的层析性能，但理论上还是会影响填料的使用寿命。强阳填料则耐受范围较宽，一般可用0.5-1M的氢氧化钠进行清洗消*。
下游纯化硬件一般采用不锈钢或多聚物材质。这些材料一般都是可以耐受1M的氢氧化钠以及一定的温度。玻璃材质则不建议用强碱进行浸泡，氢氧化钠会腐蚀玻璃，使其表面粗糙。另外某些多聚物材质对有机溶剂敏感，如丙烯酸，不能长时间接触乙醇或异丙醇。
请根据填料供应商推荐的兼容性化学物质列表进行药剂选择。
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参考文献：
[1]B.Setlow1,C.A.Loshon1,P.C.Genest1,A.E.Cowan1,2,C.Setlow1andP.Setlow1MechanismsofkillingsporesofBacillussubtilisbyacid,alkaliandethanol,/:received16Juneandaccepted13September
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